Pandemie Spezial

Denaturierung, Annealing, Elongation

Die PCR und andere Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken im Überblick

jb/eda | Es gibt mittlerweile eine Reihe von Testverfahren, um SARS-CoV-2 direkt nachzuweisen. Neben den Antigen-Schnelltests, gibt es verschiedene Methoden, virale Nukleinsäuren zu detektieren. Dabei macht man sich sogenannte Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken (oder engl. NAATs = Nucleic Acid Amplification Tests) zunutze, kurz NAT. In diesem Zusammenhang ist die Rede von PCR, PoC-NAT und PoC-PCR – was ist der Unterschied?

Bekannteste Nukleinsäure-Amplifikations-Technik (NAT) ist die PCR. PCR steht für „Polymerase Chain Reaction“. Bei der PCR wird, wie bereits im Pharmaziestudium gelehrt wird, das in Form von Nukleinsäuren vorliegende Erbgut im Probenmaterial so vervielfältigt, dass es nachgewiesen werden kann. Die Technik kommt nicht nur bei der Diagnostik von Infektionen zum Einsatz, sondern beispielsweise auch bei der Untersuchung von biologischem Spurenmaterial in Kriminalfällen oder im Rahmen von Vaterschaftstests. Ist heute von PCR die ­Rede, ist meist die sogenannte Real-­Time-PCR gemeint. Sie kommt auch beim Nachweis von SARS-CoV-2 zum Einsatz. Vor der Amplifikation wird die virale RNA übrigens mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in komplementäre DNA umgeschrieben.

Foto: Bosch

Mit Real-Time-PCR arbeitet beispielsweise Vivalytics der Fa. Bosch, analog zu den Laborgeräten gibt es auch Ct-Werte, mit einem Ergebnis innerhalb von 40 Minuten.

PCR als Goldstandard

Die Real-Time-PCR erlaubt mittels Fluoreszenzmessung eine Quantifizierung der vervielfältigten Nukleinsäuren bereits während des laufenden Prozesses, indem spezifische Sonden an die neu gebildete DNA binden, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sind. Mit der Zunahme der DNA-Menge steigt die Intensität der Fluoreszenz, bis sie messbar wird. Nach wie vielen Zyklen sie messbar wird, ist ein Parameter für die Ausgangskonzentration, im Fall von SARS-CoV-2 der Viruslast, also der Infektiosität des Probenmaterials bzw. der getesteten Person. Das spiegelt sich im sogenannten Ct-Wert (Ct = Cycle threshold, auch Cq = Quantifizierungszyklus genannt) wider. Je höher die Ausgangskonzentration, desto geringer die Anzahl der erforderlichen Temperaturzyklen, bis die Fluoreszenz ansteigt, desto geringer also der Ct-Wert.

Für die PCR wird üblicherweise die Probe an ein Labor gesendet, das die Untersuchung dann durchführt. Bis das Ergebnis vorliegt, dauert es im Regelfall einen Tag, bei hoher Auslastung auch länger. Die PCR gilt als Goldstandard in der SARS-CoV-2-Diagnostik. Sie erlaubt neben dem qualitativen Nachweis eben auch eine quantitative Aussage über die jeweilige Infektion.

Grundsätzlich können Labore auch andere NAT als die PCR anwenden, die Testverordnung deckt dies auch ab. So können beispielsweise isotherme Techniken zum Einsatz kommen. Im Gegensatz zur PCR, bei der auf 95 °C erhitzt, dann auf eine Temperatur von 50 bis 60 °C abgekühlt, im dritten Schritt die Temperatur wieder angehoben wird, in der Regel auf 72 °C, und dies dann mehrfach wiederholt wird, arbeitet man dort unter konstanten Temperaturbedingungen. Ein Beispiel hierfür ist die „Loop-mediated Isothermal Amplification“, kurz LAMP.

Bei der „Transcription-mediated Amplification“ (TMA) wird ebenfalls bei konstanter Temperatur gearbeitet. Darüber hinaus gibt es noch eine ganze Reihe anderer isothermer Amplifikationstechniken (Nicking Endonuclease Amplification Reaction = NEAR, Helicase-dependent Amplification = HDA, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats = CRISPR, Strand Displacement Amplification = SDA). Auch ID-Now von Abbott nutzt eine angeblich eigene, nicht näher spezifizierte isotherme NAT-Technologie. Das rein qualitative Ergebnis liegt nach weniger als 15 Minuten vor.

Die PCR läuft in 30 bis 50 Zyklen ab. Ein Zyklus unterteilt sich in 1. Denaturierung, 2. Annealing und 3. Elongation. Erst wird auf 95 °C erhitzt, um die DNA in ihre Einzelstränge aufzutrennen (Denaturierung). Weil Coronaviren RNA-Viren sind, muss die RNA vorher noch mithilfe des Enzyms Reverse-Transkriptase in komplementäre DNA umgeschrieben werden. Dann wird auf 50 bis 60 °C abgekühlt. Die Temperatur muss geringfügig unter der Schmelztemperatur der verwendeten Primer liegen. Nun können sich die komplementären Primer an die Einzelstränge der Ziel-Sequenz anlagern. Schließlich wird die Temperatur wieder angehoben, in der Regel auf 72 °C. Da ist die Polymerase besonders aktiv. Sie baut eine Kopie der durch die Primer markierten charakteristischen DNA-Sequenz auf.

Point of Care Tests

Neben den Untersuchungen, bei denen Probenmaterial in ein Labor gegeben wird, gibt es noch die sogenannten PoC-Tests. PoC steht für „Point of Care“. Hier wird die Analytik vor Ort vorgenommen. Das Ergebnis kann in weit weniger als einer Stunde vorliegen. Unter dem Begriff PoC-NAT versteht man also Tests, die ebenfalls auf Nukleinsäure-Amplifikations-Technik basieren, aber eben kein Labor benötigen. Für SARS-CoV-2 werden sie unter anderem in Apotheken durchgeführt.

Anwendungsgebiete, Limitationen und Kritik

All diese Tests werden unter dem Begriff PoC-NAT zusammengefasst. Die Bundesregierung misst ihnen offensichtlich für die Zukunft eine große Bedeutung bei. So wurde kürzlich ein Förderprogramm für Produktionsan­lagen für PoC-NAT-Schnelltestgeräte und für die dazu notwendigen Testkartuschen zum Nachweis von SARS-CoV-2 aufgelegt.

Die Spezifität von PoC-NAT-Tests reicht nahezu an die Spezifität von PCR-Tests heran, die Sensitivität ist jedoch etwas geringer. Nach Ansicht des Bundesgesundheitsministeriums (BMG) bieten sie sich daher zur Verifizierung positiver Schnelltestergebnisse an, wie es auf seiner Webseite schreibt. Außerdem seien sie besonders gut in Situationen geeignet, in denen man schnell ein relativ sicheres Testergebnis innerhalb kurzer Zeit benötige, wie zum Beispiel bei Testungen in Notaufnahmen, Ambulanzen und Pflegeeinrichtungen, heißt es weiter.

PoC-NAT-Schnelltests böten im Vergleich zu Antigenschnelltests auch im Reiseverkehr eine höhere Sicherheit, so das Bundesgesundheitsministerium. Allerdings werden PoC-NAT-Tests nicht überall anerkannt, auch eine Übernahme der Ergebnisse zum Beispiel in die Corona-Warn-App ist zumindest bei testenden Apotheken nicht möglich. Weil es falsch-negative Ergebnisse geben kann, sollte in sensiblen Bereichen zum Schutz eines Eintrags in Bereiche mit Personen, die ein hohes Risiko für einen schweren Verlauf haben, der PCR-Testung Vorzug gegeben werden. Auch bei Zweifeln an einem negativen PoC-NAT-Test, etwa aufgrund einer Persistenz von Symptomen, sollte eine PCR-Testung erwogen werden, rät das Ministerium.

Wenig überraschend sind es vor allem die Labormediziner, die Kritik an den PoC-NAT-Tests äußern. So erklärte der Direktor des Instituts für Labormedizin am Stuttgarter Marienhospital, Matthias Orth, gegenüber dem SWR, dass PoC-NAT-Tests nur in Einzelfällen eine Alternative zur PCR darstellten, weil sie auf Einzelmessungen ausgelegt seien. Das werde dem aktuellen Bedarf nicht gerecht. Ein weiteres Problem ist in seinen Augen, dass die Tests nicht quantitativ wären und folglich keine Ct-Werte lieferten – was im Übrigen gar nicht für alle Verfahren stimmt. Somit ließe sich nicht abschätzen, wie infektiös eine Patientin oder ein Patient ist, erklärt der Labormediziner. Daher könne mit den PoC-NAT-Tests niemand „freigetestet“ werden. |

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