A. P. Sutter et al.Der periphere Benzodiazepinrezeptor

Benzodiazepin-Bindungsstellen

Benzodiazepine werden klinisch als Muskelrelaxanzien, Antikonvulsiva, Anxiolytika und Sedativa/Hypnotika eingesetzt. Die Effekte von Benzodiazepinen werden dabei vorwiegend durch ihre Bindung an den zentralen Benzodiazepinrezeptor (ZBR) des zentralen Nervensystems (ZNS) vermittelt. Der ZBR gehört zu einem makromolekularen Komplex, der einen Chloridkanal bildet. Neben der Benzodiazepin-Bindungsstelle befindet sich dort auch eine Bindungsstelle für γ-Aminobuttersäure (GABA). Die Bindung von Benzodiazepinen am GABA_A-Rezeptor erleichtert die Bindung von GABA und verstärkt dadurch die inhibitorischen Effekte von GABA im ZNS.

Benzodiazepine binden aber auch an weitere Rezeptoren mit hoher Spezifität. Als Braestrup und Squires [1] 1977 an Ratten die Bindung von Diazepam an den ZBR untersuchten, stellten sie überraschenderweise fest, dass entgegen der bis dahin geltenden Annahme auch außerhalb des ZNS Bindungsstellen für Benzodiazepine existieren; so entdeckten sie den peripheren Benzodiazepinrezeptor (PBR). Beispielsweise bindet Diazepam mit ähnlich hoher Affinität am PBR wie am ZBR. Dies führte zu der Hypothese, dass dem PBR eine weitreichende physiologische Bedeutung zukommen muss (Tab. 1).

Pharmakologische Charakterisierung des PBR

Mithilfe verschiedener Benzodiazepine ist es möglich, zwischen dem ZBR und dem PBR zu unterscheiden. So bindet 4-Chlordiazepam (Abb. 1) mit hoher Affinität (KD im nM-Bereich) am PBR, besitzt jedoch nur eine geringe Affinität zum ZBR. Demgegenüber bindet Clonazepam mit hoher Affinität an die Benzodiazepin-Bindungsstelle des GABA_A-Rezeptors, während es nur geringe Affinität zu PBR aufweist [2].

Im Jahre 1983 entwickelten LeFur et al. eine Reihe von Isochinolincarboxamiden, die trotz ihrer strukturellen Unterschiede zu Benzodiazepinen eine hohe Affinität zum PBR besitzen, während sie keine nennenswerte Bindung am ZBR zeigen (z. B. PK 11195, Abb. 1) [3]. Im Jahre 1992 wurde eine dritte Verbindungsklasse von spezifischen Liganden des PBR beschrieben, die Indolacetamide (z.B. FGIN, Abb. 1) [4]. Die verschiedenen PBR-Liganden besitzen unterschiedliche, zum Teil sich überlappende Bindungsstellen am PBR.

Gewebespezifische Verteilung und subzelluläre Lokalisation

PBR werden in nahezu allen Geweben exprimiert. In Ovarien, Hoden, Nebennieren und der Plazenta findet man relativ große Mengen an PBR, während die PBR-Expression in der Skelettmuskulatur, dem Gastrointestinaltrakt und im Gehirn nur gering ist [5]. Bei verschiedenen Tumoren, v. a. bei Kolon- und Mammakarzinomen, Gliomen, aber auch bei Ovarialkarzinomen besteht eine PBR-Überexpression im Vergleich zum gesunden Gewebe [6].

Innerhalb der Zelle ist der PBR hauptsächlich in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert. Einzelne Befunde deuten aber auch auf eine Lokalisation in der Plasmamembran (Zellmembran) hin. So wurden plasmamembranständige PBR im Herzen, der Leber, der Nebenniere, den Hoden und auf hämatopoetischen Zellen entdeckt [7]. Die Feststellung einer (peri-)nukleären PBR-Lokalisation bei Mammakarzinomzellen [8] führte zu der Hypothese, dass nukleäre PBR möglicherweise auch als Transkriptionsfaktoren fungieren könnten. Dies ist Gegenstand aktueller intensiver Forschung.

Endogene Liganden des PBR

Die endogenen Liganden des PBR geben einen wichtigen Hinweis auf seine physiologische Bedeutung. Sein wichtigster physiologischer Ligand ist Cholesterol, das mit hoher Affinität vom PBR gebunden und ins Mitochondrium transportiert wird, wo es zur Steroidbiosynthese dient. Der PBR soll Cholesterol auch in andere Zellkompartimente transportieren und zum Aufbau von Zellmembranen bereitstellen.

Ein weiterer endogener Ligand ist der Diazepam Binding Inhibitor (DBI), ein 11 kD großes Polypeptid, das die Bindung von Diazepam sowohl am ZBR als auch am PBR der Mitochondrienmembran inhibiert, allerdings nur mit einer geringen Affinität (KD im µM-Bereich).

Andere, hochaffine endogene Liganden des PBR sind Porphyrine (Protoporphyrin IX, Mesoporphyrin IX, Deuteroporphyrin IX, Hemin), Vorstufen des roten Blutfarbstoffes Hämoglobin [6]. Die physiologischen Konzentrationen der Porphyrine reichen für eine dauerhafte Sättigung der PBR aus. Die Beteiligung an der Hämbiosynthese ist eine weitere physiologische Funktion des PBR.

Molekulare Charakterisierung

Das für den PBR codierende Gen (pbr-Gen) ist 13 kbp groß und befindet sich auf Chromosom 22 (Locus 22q13.3). Die mRNA besitzt eine Größe von 850 bp. Für den PBR sind verschiedene Splicing-Varianten bekannt, denen bisher keine unterschiedliche Funktion zugeordnet werden konnte. Die evolutiv hochkonservierte Struktur des Gens - seine speziesübergreifenden Sequenzhomologien vom Menschen bis zu Bakterien (E. coli) und Archäbakterien (Archaeoglobus fulgidus) betragen mehr als 80% - stützen die Annahme, dass der PBR ein Protein von essenzieller Bedeutung ist.

PBR ist ein 18 kD großes, kationisches, hydrophobes, transmembranäres Protein. Es enthält fünf hydrophobe Domänen (α-Helices), die die äußere Mitochondrienmembran durchziehen. Sie sind so angeordnet, dass sie eine Pore ausbilden, durch die u. a. Cholesterol transportiert werden kann. Das C-terminale Ende des PBR, an dem sich auch die Bindungsstelle des Cholesterols befindet, liegt auf der zytoplasmatischen, das N-terminale Ende auf der mitochondrialen Seite der Membran (Abb. 2) [9].

PBR-assoziierte Proteine

Der PBR wurde als Komplex mit mehreren anderen Proteinen isoliert; dies deutete darauf hin, dass er Teil eines multimeren Komplexes ist [10]. In der äußeren Mitochondrienmembran ist der PBR mit dem spannungsabhängigen Anionenkanal (voltage dependent anion channel, VDAC, Porin) und dem Adenin-Nukleotid-Translokator (ANT) assoziiert, die zusammen eine permeability transition pore (PTP) ausbilden (Abb. 3) [10, 11]. Ob VDAC und ANT für die Bindung der PBR-Liganden notwendig sind, ist umstritten: Garnier et al. [12] bejahten dies 1994. Bindungsstudien an in Liposomen rekonstituiertem PBR zeigten hingegen das Gegenteil [13]. In steroidproduzierenden Zellen wurde das Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) als zytoplasmatisches PBR-assoziiertes Protein identifiziert. Wahrscheinlich interagieren PBR und StAR beim Cholesteroltransport durch die mitochondriale Membran [14].

Kürzlich wurden mit Hilfe des Two-Hybrid-Systems zwei neue zytoplasmatische Proteine charakterisiert, die mit dem PBR interagieren: das PRAX-1 (PBR associated protein 1) [15] und das PAP-7 (PBR-associated protein 7) [16]. PRAX-1 dient möglicherweise als Adaptorprotein für zytoplasmatische oder nukleäre Effektoren, die noch nicht bekannt sind; PAP-7 ist Teil der hormoninduzierten Signaltransduktionskaskade, die zur Steroidbiosynthese führt (Abb. 3).

Funktionen des PBR

Neben der Regulation der Steroidbiosynthese [16] wurden weitere Funktionen des PBR beschrieben: Zu ihnen gehören eine Beeinflussung der mitochondrialen Atmung, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung und der Insulinsekretion sowie eine Hemmung der zellulären Immunantwort [6]. Möglicherweise hängen sie alle mit der Fähigkeit des PBR, Cholesterol zu binden, zusammen.

Eine essenzielle und über die bislang bekannten Funktionen hinausgehende Bedeutung des PBR bei der Embryogenese wurde durch Experimente an Knock-out-Mäusen festgestellt. Ein Knock-out des pbr-Gens bewirkte, dass die Entwicklung der Maus im frühen Embryonalstadium abbrach. Demgegenüber waren Knock-outs des PBR in Zellkulturen ohne Vitalitätsverlust möglich [17]: Hierbei konnte ein Einfluss des PBR auf den Cholesteroltransport und die Zellproliferation bestätigt werden.

Die wirksamen Konzentrationen der PBR-Liganden sind unterschiedlich und liegen z. T. um drei Zehnerpotenzen höher als ihre Bindungsaffinitäten zum PBR [6]. Daher wird diskutiert, ob die von PBR-Liganden berichteten Effekte überhaupt PBR-spezifisch oder eher rezeptorunspezifisch sind. Aber auch niedrigaffine Strukturanaloga der jeweiligen PBR-Liganden ohne intrinsische Aktivität scheinen eine PBR-vermittelte Wirkung zu haben [18]. Die Wirkung der synthetischen Liganden könnte auf einer Verdrängung endogener Liganden beruhen.

Bedeutung des PBR in der Onkologie

Neueste Untersuchungen zeigen die Beteiligung des PBR an der Karzinogenese und dem Wachstum verschiedener Tumoren. Vergleichende Untersuchungen der PBR-Expression in normalem Gewebe und in Tumorgewebe zeigten, dass im Laufe der malignen Transformation eine deutliche Überexpression des PBR im Tumor auftritt [5]. Die Überexpression und die (peri-)nukleäre Lokalisation des PBR beim Mammakarzinom korrelieren mit der Aggressivität der Tumorerkrankung [8]. Am Beispiel kolorektaler Karzinome konnte zudem belegt werden, dass die Überexpression des PBR im Tumorgewebe einen unabhängigen, negativen prognostischen Faktor darstellt [19].

Überraschenderweise konnte auch gezeigt werden, dass der PBR vor Apoptose (programmierter Zelltod) durch reaktive Sauerstoffspezies [20] oder durch UV-Strahlung [21] schützen kann. Damit stimmt überein, dass in den oberen, der UV-Strahlung ausgesetzten Hautschichten eine wesentlich stärkere PBR-Expression erfolgt als in tiefer liegenden Hautschichten [22].

Aufgrund der antiapoptotischen Eigenschaften des PBR begünstigt seine Überexpression eine ungehemmte Zellproliferation; dies erklärt seine negative Rolle bei Krebserkrankungen und macht ihn als Target für eine zielgerichtete Chemotherapie interessant. Untersuchungen an Zelllinien und Primärzellkulturen gastrointestinaler Karzinome zeigten, dass spezifische PBR-Liganden das Wachstum von Tumorzellen dramatisch inhibieren. Als zugrunde liegende Mechanismen wurden die Induktion der Apoptose sowie die Arretierung des Zellzyklus identifiziert.

PBR-Ligand-vermittelte Apoptose

Die Aufklärung der Signaltransduktionswege, auf denen PBR-Liganden diese Effekte vermitteln, ist Gegenstand intensiver Forschung. Als weitgehend gesichert gilt, dass die Apoptose über eine PBR-gesteuerte Freisetzung mitochondrialer Apoptose-Initiatoren induziert wird [23]. Hierbei spielt die in der Mitochondrienmembran lokalisierte permeability transition pore (PTP), deren integrativer Bestandteil PBR ist, eine entscheidende Rolle. Die Öffnung der PTP führt zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotenzials (ΔΨM) und zum Austritt von mitochondrialen Proteinen wie Cytochrom C oder apoptosis-inducing factor (AIF), die schließlich Caspasen (wichtige Apoptose-induzierende Enzyme) aktivieren [24].

Die Lokalisation des PBR in der äußeren Mitochondrienmembran und seine Beteiligung an der PTP legen nahe, dass der PBR die Permeabilität der äußeren Mitochondrienmembran und die mitochondriale Apoptose-Induktion moduliert [25]. Fischer et al. [26] konnten zudem eine Beteiligung des PKB/Akt-Signalweges sowie mitochondrialer pro- und antiapoptotischer Proteine der BCL-Familie bei PBR-Ligand-induzierter Apoptose von Kupfferschen Sternzellen der Leber nachweisen. Zisterer et al. [27] zeigten die Beteiligung des JNK-Signalweges bei der PBR-Ligand-vermittelten Apoptose. Die Bedeutung mitochondrialer Veränderungen für die PBR-Ligand-vermittelte Apoptose beschrieben Sutter et al. [28].

PBR-Ligand-vermittelte Arretierung des Zellzyklus

Es konnte gezeigt werden, dass PBR-Liganden den Zellzyklus in der G₁/G₀-Phase unterbrechen. Dies ist neben der Auslösung von Apoptose ein weiterer vielversprechender Ansatzpunkt zur Kontrolle und Verlangsamung des Tumorwachstums. Indem PBR-Liganden den Übergang von der G₁- in die S-Phase verhindern, wirken sie auf eine ähnliche Art und Weise wie Inhibitoren Zyklin-abhängiger Kinasen (z. B. Flavopiridol und 7-Hydroxystaurosporin (UCN-01)), die gegenwärtig große Beachtung als neuartige, hocheffiziente Antitumorwirkstoffe finden.

PBR-Liganden in Kombinationstherapien

Die Überexpression des PBR in Tumoren kann auch für ein tumorspezifisches Targeting etablierter Chemotherapeutika wie Gemcitabin genutzt werden; Konjugate aus dem PBR-Liganden PK11195 und dem Zytostatikum Gemcitabin wurden bereits entwickelt und werden geprüft [29]. Auch für Kombinationstherapien sind PBR-Liganden interessant: Sie potenzieren die zytotoxische Wirkung von TNF-α [30] und sensibilisieren Leukämiezellen gegenüber etablierten Zytostatika wie Daunorubicin oder Cytarabin [31].

Photodynamische Therapie

Ein weiterer interessanter Ansatzpunkt für künftige PBR-basierte Tumortherapien ist die photodynamische Therapie. Sie beruht darauf, dass eine photosensibilisierende Substanz durch Bestrahlung aktiviert wird und lokal zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (z. B. Singulett-Sauerstoff und Superoxid-Anionen) führt, die wiederum die Tumorzellen zerstören. Als Photosensibilisatoren dienen u. a. Porphyrine, die hochaffin am PBR binden. Aufgrund der bereits beschriebenen Überexpression des PBR in Tumoren erscheint eine tumorspezifische photodynamische Therapie mit Porphyrinen möglich [32].

Abschließende Betrachtungen

Unser Verständnis über die physiologische Bedeutung des PBR ist zwar noch lückenhaft, die bisherigen Daten zeigen aber, dass es sich um ein vielversprechendes Zielprotein innovativer Therapieansätze in der Onkologie handelt.

Die Bedeutung des PBR für die Proliferation von Zellen ist mit der Regulation des Cholesteroltransports, eventuell auch mit der Regulation der Zellatmung, eng verknüpft. Fehlfunktionen des PBR könnten daher in manchen Geweben zu Krebserkrankungen führen. Die Zahl der Veröffentlichungen nimmt zu, die über eine Rolle des PBR in Apoptose und Zellproliferation berichten. Auch eine Modulation der Funktion des Immunsystems durch PBR sollte in Betracht gezogen werden.

Für viele Tumoren ist eine Überexpression des PBR beschrieben worden, und kürzlich konnten wir zeigen, dass eine hohe Überexpression des PBR in kolorektalen Karzinomen mit einer schlechteren Prognose der Patienten einhergeht [19].

Eine Modulation des PBR durch PBR-Liganden ist ein innovativer, vielversprechender Ansatzpunkt für eine selektive Chemotherapie von malignen Tumoren. Die Synthese noch spezifischerer Liganden mit geringerer Toxizität sowie die Aufklärung der Signaltransduktionswege, die zu der PBR-Ligand-vermittelten Apoptose und zur Unterbrechung des Zellzyklus führen, werden die zukünftigen Aufgaben sein.

Zusammenfassung

• Der PBR ist ein ubiquitär verbreitetes Protein; er kommt hauptsächlich in der Mitochondrienmembran vor und ist dort mit der permeability transition pore assoziiert.
• Der PBR reguliert vor allem den Cholesteroltransport in die Mitochondrien und damit die Steroidbiosynthese.
• PBR-spezifische Liganden sind an Wachstumskontrolle und Differenzierung von Zellen beteiligt.
• In Tumoren herrscht eine Überexpression des PBR.
• PBR-Liganden könnten in Zukunft Pharmaka für einen innovativen, vielversprechenden Therapieansatz von Tumorerkrankungen darstellen.

Kastentext: Abkürzungen

ΔΨM: mitochondriales Membranpotenzial AIF: Apoptose-induzierender Faktor ANT: Adenin-Nukleotid-Translokator BCL-2: B-cell lymphoma like protein 2 DBI: Diazepam binding inhibitor GABA: γ-Aminobuttersäure JNK: c-Jun N-terminale Kinase PAP: PBR-assoziiertes Protein PBR: Peripherer Benzodiazepinrezeptor PKB/Akt: Proteinkinase B PRAX: PBR-assoziiertes Protein PTP: Permeability transition pore StAR: Steroidogenic acute regulatory protein TNF-α: Tumor-Nekrose-Faktor α VDAC: Voltage dependent anion channel, Porin ZBR: Zentraler Benzodiazepinrezeptor

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