Arabinogalaktan-Proteine als Immunstimulanzien

Struktur des Polysaccharidanteils der AGPs

Die Polysaccharidseitenketten können meistens dem Strukturtyp II zugeordnet werden, bei dem sich jeweils ein Rückgrat aus 1,3-verknüpfter β-D-Galaktose findet, das weitere 1,6-verknüpfte β-D-Galaktopyranosyl-Seitenketten trägt. Diese Seitenketten können ihrerseits verzweigt und mit Arabinoseresten sowie terminalen Glucosen, Glucuronsäuren und Rhamnosen substituiert sein [9]. Für die AGPs aus Echinacea purpurea und Baptisia tinctoria wurde die Zugehörigkeit zum Strukturtyp II bereits anhand struktureller Untersuchungen nachgewiesen [10, 11]. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede sowohl im Verzweigungsgrad als auch in der Zusammensetzung der endständigen Monosaccharide.

Reaktion mit polyklonalen Antikörpern

Das AGP aus Echinacea purpurea wurde als Antigen zur Produktion polyklonaler Antikörper im Kaninchen eingesetzt. Die Reaktion dieser Antikörper mit den verschiedenen AGPs zeigt Abbildung 5. Wie erwartet, binden die Antikörper sehr gut an das AGP aus Echinacea purpurea. Dagegen sind die Kreuzreaktivitäten der drei anderen AGPs relativ schwach ausgeprägt, wobei das AGP der systematisch am entferntesten stehenden Art Baptisia tinctoria erstaunlicherweise am stärksten reagiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass Übereinstimmungen in der summarischen Zusammensetzung der AGPs nicht zu gleichen Strukturen und damit gleichen Epitopen führen müssen. Die Variationsmöglichkeiten – besonders im Bereich der endständigen Zuckergruppierungen der Polysaccharidseitenketten – sind groß und führen wahrscheinlich zur Bildung zahlreicher unterschiedlicher Epitope. Variationen in der Feinstruktur können somit auch zu Unterschieden in der biologischen Aktivität führen.

Fazit

Die hier vorgestellten Untersuchungen sind ein erster Schritt auf der Suche nach Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Arabinogalaktan-Proteinen. Nur durch strukturelle Charakterisierung möglichst reiner AGPs wird es möglich sein, die für immunmodulatorische Wirkungen verantwortlichen Strukturen dieser Glykoproteine zu identifizieren.

Material und Methoden

Der Presssaft aus den oberirdischen Teilen von Echinacea purpurea (L.) Moench, Asteraceae, wurde von Fa. Madaus AG, Köln, zur Verfügung gestellt, die Wurzeln von Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. wurden von Fa. Galke, Gittelde, bezogen. Rudbeckia hirta L., Asteraceae, wurde im Botanischen Garten des Pharmazeutischen Institutes der Universität Kiel aus Samen gezogen. Die Wurzeln von Baptisia tinctoria (L.) R. Brown, Fabaceae, wurden von Fa. Schaper & Brümmer GmbH & Co. KG, Salzgitter, zur Verfügung gestellt.

Die Herstellung von β-Glucosyl Yariv's Reagenz (1,3,5-Tris-[4-β-D-glucopyranosyl-oxyphenylazo]-2,4,6-trihydroxy-benzol; Abb. 6) erfolgte nach der Vorschrift von Yariv et al. [12].

Isolierung von AGPs Der Presssaft von Echinacea purpurea (10 l) sowie die wässrigen Extrakte (4 l) der oberirdischen Teile von Rudbeckia hirta (200 g), der Wurzeln von Echinacea pallida (800 g) und der Wurzeln von Baptisia tinctoria (400 g) wurden in kleinen Portionen (50 ml) 10 min lang zum Sieden erhitzt. Nach Zentrifugation (5000 g, 5 min) wurde aus dem Überstand durch Tangentialflussfiltration (Molecular-weight-cut-off = MWCO 50.000 D für E. purpurea, MWCO 30.000 D für R. hirta, E. pallida und B. tinctoria, Membran Biomax, Millipore, Eschborn) eine hochmolekulare Fraktion aufgereinigt und gefriergetrocknet. Jeweils 400 mg dieser Fraktion wurden in 50 ml Aqua bidestillata gelöst und die Arabinogalaktan-Proteine durch Zusatz von 50 ml einer Lösung von β-Glucosyl Yariv's Reagenz (1 mg/ml) und Kochsalz (Endkonzentration 0,15 M) ausgefällt [13]. Der AGP-Yariv-Komplex wurde über Nacht bei 4 °C stehen gelassen, dann abzentrifugiert (10.000 g, 15 min) und in 50 ml Aqua bidest. gelöst. Durch Zusatz von Na2S2O4 und kurzzeitiges Erwärmen auf 50 °C wurde der Komplex zerstört [14], die Lösung 4 Tage lang gegen Aqua bidest. dialysiert (MWCO 12 – 14.000 D) und die aufgereinigten AGPs gefriergetrocknet.

Analytische Verfahren Die neutralen Monosaccharide (Tab. 2) wurden nach Hydrolyse (TFA 2 M, 1 h, 121°C) als Alditolacetate gaschromatographisch bestimmt ([15], Säule OV 225: 0,25 mm x 25 m, Macherey & Nagel, Düren). Die Auswertung erfolgte dabei über FID unter Verwendung von myo-Inositol als internem Standard.

Der Gehalt an Uronsäuren (Tab. 3) wurde photometrisch nach der Methode von Blumenkrantz und Asboe-Hansen [16] ermittelt. Der Bindungstyp der Zucker im Polysaccharid wurde durch Methylierungsanalyse [17] mit GC-MS-Kopplung ermittelt. Nach massenspekrometrischer Identifizierung der partiell methylierten/acetylierten Zuckerderivate erfolgte die gaschromatographische Trennung (Säule OV 1701: 0,25 mm x 25 m, Macherey & Nagel, Düren) und die Auswertung über FID.

Die Bestimmung von Hydroxyprolin (Tab. 1) erfolgte photometrisch nach der Vorschrift des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LMBG § 35, L06.00/8).

Herstellung und Affinitätsreinigung der polyklonalen Antikörper Das AGP aus dem Presssaft von Echinacea purpurea wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und mit dem gleichen Volumen an Freund's Adjuvanz vermischt. Diese Mischung wurde mehrmals subkutan in zwei Kaninchen (0,3 mg AGP/Injektion/Tier, Charles River, Kißlegg) injiziert. Polyklonale Antikörper wurden aus dem Antiserum durch Affinitätschromatographie an einer Arabinogalaktan-Hydra®-Matrix (Squarix, Marl) aufgereinigt. Ein Teil der Antikörper wurde anschließend mit alkalischer Phosphatase gekoppelt (Squarix, Marl).

ELISA Mikrotiterplatten (96 Löcher, Nunc, Roskilde, DK) wurden mit der Antikörper-Lösung bei 4 °C über Nacht beschichtet (Verdünnung 1:1000 in PBS-Puffer, 100 µl/Loch). Die beschichteten Platten wurden anschließend dreimal gewaschen (Waschlösung PBS mit 0,05% Tween 20). Freie Bindungsstellen wurden abgesättigt (0,1% Rinderserumalbumin in PBS, 200 µl/Loch, 1 h bei 36 °C) und die Platte wiederum gewaschen. Die AGPs wurden in verschiedenen Konzentrationen (0,5 –100 µg/ml) zugefügt (50 µl/Loch), die Platten bei 36 °C 1,5 h inkubiert, gewaschen und mit dem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper behandelt (Verdünnung 1 : 250 in PBS, 100 µl/Loch, 1 h bei 36 °C). Nach einem weiteren Waschvorgang wurde das Substrat zugegeben (0,1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,2 M Tris Puffer, 100 µl/Loch) und die Absorption nach 30 min bei einer Wellenlänge von 405 nm in einem ELISA Reader gemessen.

Danksagung:

Die Autoren danken der Firma Madaus AG, Köln für die Finanzierung der Arbeiten an Echinacea purpurea.

[1] Bauer R: Echinacea  – eine Arzneidroge auf dem Weg zum ra- tionalen Phytotherapeutikum. Dtsch. Apoth. Ztg. 1994; 134: 94! ! ! ! – ! ! ! !103.

[2] Stimpel M, et al.: Macrophage activation and induction of ma- crophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea. Infect. Immun. 1984; 46: 845 – 849.

[3] Wagner H, et al.: Immunstimulierend wirkende Polysac- charide (Heteroglykane) aus höheren Pflanzen. Arzneim.- Forsch. 1985; 35: 1069 – 1075.

[4] Beuscher N, Bodinet C, Willigmann I, Egert D: Immunmodu- lierende Eigenschaften von Wurzelextrakten verschiedener Echinacea-Arten. Z. Phytother. 1995; 16: 157 – 166.

[5] Alban S, Classen B, Brunner G, Blaschek W: Differentiation between the complement modulating effects of an arabinoga- lactan-protein from Echinacea purpurea and heparin. Planta Med. 2002; 68: 1118 – 1124.

[6] Bacic A, et al.: Structural classes of arabinogalactan-proteins. In: Nothnagel EA, et al. (Eds.): Cell and Developmental Biology of Arabinogalactan-Proteins. Dordrecht/New York 2000: 11 – 23.

[7] Gane AM, et al.: Structural analysis of the carbohydrate moiety of arabinogalactan-proteins from stigmas and styles of Nicotiana alata. Carbohydr. Res. 1995; 277: 67 – !85.

[8]  Fincher GB, Stone BA, Clarke AE: Arabinogalactan-proteins: structure, biosynthesis and function. Annu. Rev. Plant Physiol. 1983; 34: 47 – 70.

[9] Aspinall GO: Classification of Polysaccharides. In: Aspinall GO (Ed.): The Polysaccharides. New York 1982: 1 – 9.

[10] Classen B, Witthohn K, Blaschek W: Characterization of an arabinogalactan-protein isolated from pressed juice of Echina- cea purpurea by precipitation with the ‚-glucosyl Yariv re- agent. Carbohydr. Res. 2000; 327: 497 – 504.

[11] Wack M: Isolierung und Charakterisierung von Arabinoga- lactan-Proteinen aus Baptisia tinctoria und Baptisia australis. Diss. Kiel 2004.

[12] Yariv J, Rapport MM, Graf L: The interaction of glycosides and saccharides with antibody to the corresponding phenylazo glycosides. Biochem. J. 1962; 85: 383  – 388.

[13] Kreuger M, van Holst GJ: Arabinogalactan Proteins are essential in somatic embryogenesis of Daucus carota L. Plan- ta 1993; 189: 243 – 248.

[14] Kreuger M, van Holst GJ: Arabinogalactan-protein epitopes in somatic embryogenesis of Daucus carota L. Planta 1995; 197: 135 – 141.

[15] Blakeney AB, et al.: A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr. Res. 1983; 113: 291– !299.

[16] Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G: New method for quantita- tive determination of uronic acids. Anal. Biochem. 1973; 54: 484 – 489.

[17] Harris PJ, et al.: An improved procedure for the methylation analysis of oligosaccharides and polysaccharides. Carbohydr. Res. 1984; 127: 59 – 73.